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支原體PCR檢測(cè)試劑盒的操作步驟
發(fā)布日期：
2017-01-06
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支原體PCR檢測(cè)試劑盒中含有PCR反應(yīng)所需要各種試劑組分，如：引物、dNTPs、緩沖液、Taq酶、穩(wěn)定劑等。PCR反應(yīng)液中加入檢測(cè)樣品和Taq酶，即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳染色判斷，陽性樣本將在290bp處出現(xiàn)特異性條帶。
1.收取待檢樣品（貼壁細(xì)胞：細(xì)胞生長(zhǎng)至80％左右即可，送檢細(xì)胞不能用消化液消化細(xì)胞，可以使用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞；懸浮細(xì)胞：細(xì)胞生長(zhǎng)至80％左右即可），取150ul（約1～3×105細(xì)胞數(shù)）至離心管，沸水浴10min 。
2.將煮沸過的細(xì)胞懸浮液12000rpm離心2-5min。
3.取上清4ul作為PCR反應(yīng)模板。
4.充分融化PCR反應(yīng)液，按下列表格配制反應(yīng)混合液，并以21ul/管分裝至PCR反應(yīng)管中。
5.每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入處理好的樣品4ul,DNA陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各加入4ul/管。
6.將所有PCR反應(yīng)管放入PCR儀，參照以下參數(shù)運(yùn)行PCR儀。
7. 取5ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠上直接點(diǎn)樣（注：無需再加溴酚藍(lán)，擴(kuò)增產(chǎn)物已包含溴酚藍(lán)），120V電泳20分鐘（可根據(jù)電泳儀的情況，適當(dāng)調(diào)整參數(shù)）。
8. EB染色觀察。
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